脂肪细胞是脂肪组织中最丰富的细胞类型，它们的功能障碍是肥胖相关病理(如癌症)的重要驱动因素。(1)驱动脂肪细胞的维持和分泌活性，(2)介导癌细胞对脂肪细胞衍生因子的反应的机制尚不完全清楚。为了解决这一知识空白，我们研究了Src同源区2-含蛋白(SHP2)活性的改变如何影响脂肪细胞功能和肿瘤串扰。我们发现肥胖小鼠、肥胖患者和分化脂肪细胞的脂肪组织中磷酸化- shp2水平升高。免疫荧光和免疫沉淀分析以及硅蛋白-蛋白相互作用模型表明，SHP2与PDHA1相关，并且这种正相关促进了活性氧(ROS)驱动的脂肪生成程序。因此，SHP2-PDHA1-ROS调控轴对于脂肪细胞维持和白细胞介素-6 (IL-6)的分泌至关重要，IL-6是一种关键的促癌细胞因子。用SHP2、PDHA1或ROS抑制剂处理的成熟脂肪细胞显示出前脂肪分解和产热蛋白水平的增加，对应于甘油释放的增加，但分泌的IL-6受到抑制。脂肪细胞-癌细胞串扰的功能分析表明，迁移、侵袭减少，细胞周期轻微抑制，这与胰腺癌细胞暴露于条件培养基(CM)(来自成熟脂肪细胞，先前用SHP2/PDHA1/ROS抑制剂处理)中的生长减少相对应。重要的是，脂肪细胞CM对PDAC细胞生长的刺激与PDHA1诱导相关，但被PDHA1抑制剂抑制。这些数据表明:(1)SHP2-PDHA1-ROS在脂肪细胞维持和分泌活性中的新作用;(2)PDHA1作为胰腺癌细胞对脂肪细胞衍生因子反应的调节剂。
脂肪组织是促癌信号的主要来源(Zyromski et al. 2009;Rebours et al. 2015)。脂肪组织和癌症之间的联系涉及免疫细胞，如巨噬细胞(Mayi et al. 2012;Wunderlich et al. 2018;Tiwari et al. 2019)，淋巴细胞(Del Corno et al. 2018;Wunderlich et al. 2018)，中性粒细胞(Quail et al. 2017;Gummlich 2021)，也可能涉及非免疫细胞。作为脂肪组织中最丰富的非免疫细胞成分，研究表明，脂肪组织细胞或脂肪细胞足以驱动多种癌症类型的进展(Nieman et al. 2011;Huang et al. 2017;Wu et al. 2019)。针对脂肪细胞-癌症的串扰需要了解脂肪细胞的维持和识别驱动功能性癌细胞反应的脂肪细胞来源的分子信号。
线粒体是促进细胞能量和能量代谢的自主细胞器。正常线粒体功能的破坏与肥胖、炎症和/或癌症的发展/进展等病理有关(Ahn and metallo 2015)。丙酮酸脱氢酶α亚基1 (PDHA1)介导丙酮酸代谢为乙酰辅酶A是线粒体的一个关键功能(Zhou et al. 2001;Sun et al. 2015;Cai et al. 2020)。乙酰辅酶A作为导致ATP生成或脂肪生成的级联反应的底物(Sun et al. 2015;Cai et al. 2020)。这一过程也是活性氧(ROS)生成的主要来源(Li et al. 2013)。PDHA1抑制以及随后丙酮酸代谢和ROS生成的破坏与小鼠炎症反应的降低相关(Li et al. 2017)。重要的是，在肥胖脂肪组织以及脂肪形成过程中发现了ROS水平升高(Furukawa et al. 2004)。然而，ros驱动脂肪细胞维持的介质以及该机制在脂肪细胞-癌细胞串扰中的功能尚不完全清楚。
SHP2是一种酪氨酸磷酸酶，参与多种细胞过程，如发育、分化(Feng 2007;Wang et al. 2021)和代谢(Zhang et al. 2004;Niogret et al. 2019)。据报道，脂肪特异性缺失SHP2会导致脂肪减少(He et al. 2013)。另外，SHP2也是一种原癌蛋白，因其在癌症发生和进展中的内在作用而闻名(Ruess et al. 2018)。事实上，据报道，胰腺特异性缺失SHP2可以抑制胰腺上皮内瘤变(PanIN)的形成并预防胰腺癌的发展(Ruess et al. 2018)。虽然SHP2对肿瘤内在信号的靶向作用正在进行中，但在脂肪细胞-肿瘤串扰方面，尚未研究SHP2抑制对脂肪细胞的影响。然而，胰腺内和胰腺间脂肪细胞的脂肪浸润(脂肪变性)增加了脂肪细胞-胰腺癌的串扰(Mendonsa et al. 2015)并与转移性疾病相关(Mathur et al. 2009)。虽然脂肪细胞衍生因子如脂肪因子可以促进胰腺癌的进展(Mendonsa et al. 2015)，但调节这些脂肪因子分泌的过程以及脂肪因子一旦分泌导致胰腺癌的机制尚不完全清楚。目前的研究表明，SHP2-PDHA1-ROS调控轴在脂肪细胞维持和脂肪细胞-肿瘤细胞串扰中起作用。
从ATCC获得3T3-L1前脂肪细胞(cat# CL-173)和脂肪来源的间充质干细胞(adMSC, cat# PCS-500-011)。小鼠前脂肪细胞维持在高糖(4.5 g/L) Dulbecco 's Modified Eagle Media, DMEM (ThermoFisher Scientific)中，添加10%热灭活牛血清(R&D Systems-Atlanta Biologicals)和抗生素抗真菌药(ThermoFisher Scientific)中，而人类前脂肪细胞维持在间充质干细胞生长培养基(cat# PCS-500-030和PCS-500-040, ATCC)中。K8484和Panc10.05细胞系之前已经被描述过(Manley et al. 2022)。乙酰辅酶A、硝基蓝四氮唑(NBT)、n -乙酰半胱氨酸(NAC)和H2O2购自Sigma-Aldrich。2X SYBR绿色主混合料(型号# K1070)购自APExBIO (Houston, TX)。SHP099(猫。# S8278)和CPI-613 (cat# S2776;PDHA1抑制剂)均来自Selleckchem。对于药物/化合物处理，在DMSO中制备40 mM SHP099或200 mM PDHA1抑制剂的原液，并在水中进一步稀释(1:1比例)，然后在培养基中重建所需的最终浓度;在整个实验过程中，取适量的50% DMSO(水中)作为对照。NAC最初溶于水。NAC、SHP099和PDHA1抑制剂使用相同的载体处理对照，NAC原液用DMSO(1:1比例)稀释，然后在培养基中重组最终所需浓度。每36-48 h补充一次培养基。
为了诱导脂肪形成，将2天过融合的前脂肪细胞从正常生长培养基中切换到分化培养基中，分化培养基由高糖DMEM补充10% FBS，胰岛素(cat# I0516, Sigma;3T3-L1 1μg/ml, adMSC 3μg/ml)，地塞米松(cat# 11015 Cayman Chemicals;10μg/ml)，罗格列酮(cat# 71740, Cayman Chemicals;3μg/ml)和IBMX (cat# I5879, Sigma;10μg/ml)维持2天(adMSC为4天)，然后用仅含胰岛素(1μg/ml)的10% FBS维持DMEM;此后每两天更换一次媒体。
在指定的时间点，将脂肪细胞培养基替换为无血清培养基，或者在进行处理时，首先用1X PBS洗涤细胞，培养24小时。然后以1:1的比例添加新鲜的无血清培养基，用于下游应用。
免疫印迹法此前已有描述(Messaggio et al. 2017)。蛋白样品采用BCA (Pierce)定量。每车道载20 ~ 30μg蛋白质。从细胞信号技术中获得抗pSHP2 [Y542(猫号3751)]、SHP2(猫号3397)、PDHA1(猫号3205)、HK1(猫号2024)、Lamin B1(猫号12586)、p-AMPKα[猫号2535)]、UCP1(猫号14670)、Perilipin-1(猫号9349)、β -actin(猫号4970)和GAPDH(猫号5174)的抗体。Glut1来自Invitrogen公司(cat# PA1-46152)。微管蛋白(编号# E7-s)购自Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA)。
对于Oil Red O染色，细胞用1X PBS冲洗，在福尔马林中固定45分钟，再用60%异丙醇冲洗，然后用Oil Red O染色(cat# A12989, Alfa Aesar;5 mg/ml)在60%异丙醇中洗涤15min。将染色的细胞在60%异丙醇中洗涤至少3次，每次15s，并置于蒸馏水中在显微镜下观察。
之前已经建立并报道了用于分离线粒体的方案(Cai et al. 2020)。简单地说，细胞在mtiso缓冲液[3 mM HEPES (pH 7.4)， 210 mM甘甘醇，70 mM蔗糖和0.2 mM EGTA]中通过Dounce均质化[约50次(上下)]裂解。匀浆在50ml管中堆积在340 mM蔗糖溶液上，在500×g(10分钟，4°C)离心，去除细胞核和未破碎的细胞作为球团。然后，将上清收集在1.5 ml的管中，在10,000×g(10分钟，4°C)离心，分离成球粒的线粒体。之前已经对IP进行了描述(Olou et al.2017)，并进行了修改。简单地说，将分离的线粒体颗粒在CHAPS缓冲液中裂解(0.3%的3-(3-胆酰胺丙基)-二甲酰胺)-1-丙磺酸(CHAPS)， 20 mM Tris-HCL (pH7.4)， 120 mM NaCl, 10%甘油和5 mM EDTA)，裂解物与SHP2或与Dynabeads (Thermofisher)交联的IgG抗体在4度下孵育过夜。
从蛋白质数据库中下载了SHP2 (PDB ID: 2SHP)和PDHA1 (PDB ID: 1NI4)的蛋白结构。这些PDB文件通过去除配体、水分子和额外的氨基酸链来制备对接。两个蛋白都选择了A链。我们进一步使用gramx蛋白-蛋白对接webserver v.1.2.0 (http://vakser.compbio.ku.edu/resources/gramm/grammx/) (Tovchigrechko and Vakser 2005, 2006)使用默认设置预测SHP2与PDHA1的结合。研究了大约10种蛋白质-蛋白质复合物模型。根据氢键数、键距选择最佳预测模型，并使用Pymol进行可视化(Alexander et al. 2011)。
将2000个细胞在96孔板上重复接种，暴露于条件培养基(CM)中，用MTT (0.5 mg/ml)试剂孵育1.5 h。去除培养基，将晶体溶解在DMSO中，在570 nm处读取吸光度。
细胞在IF室(Fisher Scientific)中播种并用分化因子刺激。对于IF，取出孵育室，将载玻片与细胞一起用PBS洗涤3次，然后(1)细胞在2%缓冲的福尔马林PBS中室温(RT)固定30分钟，(2)清洗3次(PBS每次5分钟)。然后用0.1% Triton在TBS中渗透30分钟，然后用驴血清IF缓冲液(10 mM Tris pH 7.4, 0.1 M MgCl2, 0.5% Tween20, 2% BSA, 5%驴血清)在RT下阻断1小时。细胞用一抗(1:100)在阻断缓冲液中(用TBS稀释，1:1比例)在4摄氏度下染色过夜。第二天，用0.05% Triton在TBS中洗涤细胞3次(每次5分钟)，然后用2°抗体(Alexa-fluor dye, Invitrogen;1:2000)和Hoescht核染料(1:2000)在0.05% Triton-TBS中在摇床上RT加热1小时。最后，在0.05% Triton-TBS中洗涤4次(每次10分钟)，然后装上并在荧光显微镜下观察。所用的SHP2抗体(cat# LF-MA0186，赛默飞世尔)来源于小鼠，PDHA1抗体(cat# 3205，细胞信号传导)来源于兔源。
NBT (cat# N6876, Sigma)是一种黄色粉末，在ROS存在下，会被还原成深蓝色晶体，因此可以看到ROS。对于该实验(Furukawa et al. 2004)，将细胞与0.2% NBT在PBS中孵育1.5小时，然后切换到PBS。将晶体在显微镜下观察和成像，然后溶解在50%的乙酸中，随后在560nm处读取吸光度。DHE实验按照制造商的方案(Abcam，编号ab236206)进行。
为了释放甘油，23天的成熟脂肪细胞在无酚红无血清培养基中处理。根据制造商的方案(Neogen, cat# K-GCROL)收集培养基并用检测试剂孵育。
此前已有报道(Manley et al. 2022)。简而言之，细胞在96个孔中培养，根据制造商的方案(开曼化学;猫# 600450)。
PDAC细胞(50 K)接种于上腔(24孔插入，孔径8μm;康宁公司(Corning Incorporated，编号3422)将transwell放入无血清培养基中。将600μL条件培养基移液到平板底腔中，与插入物底部接触。植入物被涂上(侵袭)或未涂上(迁移)Matrigel，并在细胞播种前在培养箱中凝固。实验结束后，使用棉签涂抹器从transwell的上表面去除没有迁移/入侵的细胞。然后先将迁移或入侵细胞固定在70%乙醇中，用0.2%结晶紫染色10分钟。将染色液溶解在50%的乙酸中，在590nm处读取吸光度。
将250 K细胞接种于6孔板中，在无血清培养基中同步24 h，然后暴露于条件培养基中18 h。随后进行碘化丙啶(PI)染色，包括RNAse孵育，并通过流式细胞术评估细胞周期期。使用FlowJo软件进行分析。采用PI强度法测定细胞周期各期细胞的百分比，并进行定量。
小鼠IL-6定量检测使用Quantikine ELISA免疫测定试剂盒(研发系统，cat# M6000B)。简而言之，在无血清处理23天分化的脂肪细胞后，根据制造商的方案收集培养基并用于检测。
培养基中IL-6的水平首先采用如上所述的定量ELISA法测定。然后用IL-6抗体孵育培养基(cat# 16706181;Thermo Scientific, 50 ng/mL)过夜，用于培养PDAC细胞;IgG抗体作为对照。
之前已经描述了协议(Messaggio et al. 2017)。qPCR程序按照主混合物供应商(APExBIO)的协议中的三步法进行，程序如下:初始变性(保持;1循环):95°C 2分钟;40个循环变性(95°C 15 s)，退火(50-60°C 30 s)和延伸(72°C 30 s)，然后是95°C 15 s, 60°C 1 min和95°C 15 s的循环。所使用的引物(如下)是特定于小鼠物种的:
PDHA1转发:TGATCCGCCTTTAGCTCCATC;反向:TGTGACCTTCATCGGCTAGAA。
Ptpn11 (SHP2): cat# QT00103362, Qiagen。
对于2NBDG摄取试验，脂肪细胞在96孔板中分化，然后葡萄糖和血清饥饿40分钟，然后用2NBDG(200μM, Cayman Chemical, Cat# 11046)在PBS中孵育80分钟。最后，用PBS洗涤细胞，通过板读在激发475 nm，发射550下测量2NBDG含量。
为了产生SHP2敲低细胞，从Millipore Sigma (Burlington, MA USA)获得了短发夹RNA (shRNA)构建物，具有混乱的SCR或靶向SHP2 mRNA的两个独立区域。将这些构建体与包装构建体(pCMV-dR8.2 #8455和pcmv - vsv - g# 8454，添加基因)一起转染HEK293T细胞，产生病毒上清液，然后用于转导指定的细胞，从而产生包装的慢病毒。转染成功的细胞用puromycin(2μg/mL)处理，直到未感染的细胞明显完全死亡。
先前已经描述了方法(Mendonsa et al. 2015)。简而言之，小鼠接受标准饮食或高脂肪饮食(TD88137 Teklad, 42%的热量来自脂肪，42.7%来自碳水化合物，15.2%来自蛋白质)三个月，期间测定体重并收集组织。动物按照堪萨斯大学医学中心的机构动物护理和使用委员会(IACUC)处理。
脂肪组织样本通过生物标本库从堪萨斯大学医学中心术前同意的去识别患者中获得。患者的身体质量指数(BMI)范围广泛，分为正常(18-24)、超重(25-29)和肥胖(30以上)。
对于统计显著性的评估，使用Sidak多重比较检验/Dunnett多重比较检验进行普通单因素方差分析(ANOVA)，或者当只有两个样本组时，使用t检验。使用GraphPad Prism9软件进行测试。P < 0.05为差异有统计学意义。
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